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ShangHai ToYongBio Tech.Inc.
上海拓旸生物科技有限公司

PEG修饰产物的分离纯化方法

沉淀法

蛋白质在一定浓度的盐溶液或有机溶剂中会发生沉淀,而PEG由于其两亲性则继续保持溶解状态,通过简单的离心就能将蛋白质与PEG分离开来。唐微等采用硫酸氨沉淀法可将rIL-2和PEG完全分离开。

膜过滤法

透析膜或超滤膜上具有一定孔径大小的微孔,若在膜中加入不同分子量的混合物,则小于孔径的分子会透过膜,而大分子则留在原处。由于分辨率低,一般仅用其除去修饰混合物中的游离PEG或浓缩分离产物超滤法适合于分离产物的浓缩和换液,与沉淀法相比活性损失小,无需脱盐,但缺点是成本较高,易吸附蛋白。

凝胶过滤层析法

凝胶过滤层析的分离原理是分离颗粒介质中具有大量孔径均一的网状孔道。分离样品中的小分子物质可以进入颗粒内部,所经历的路程较长,因此流出时间较长,后出峰;大分子物质从颗粒外通过,因此先出峰,据此可以分离不同分子量的物质。PEG修饰蛋白质的分子量大于天然蛋白质,因此出峰较天然蛋白质早,PEG偶联越多,修饰蛋白质出峰越早。McGoff等用GF柱分离PEG修饰SOD,可将未修饰、单点、两点修饰SOD分开。

离子交换层析法

离子交换层析在分离纯化蛋白质的层析手段中使用最广泛,其分离原理是离子交换树脂结合带有大量电荷的侧链,当溶液pH偏离等电点时,蛋白质就会带电荷,若所带电荷与离子交换树脂侧链电荷相反,蛋白质就可与之结合,结合的蛋白质可根据结合力的不同用不同浓度的盐离子洗脱,从而达到分离纯化效果。影响PEG修饰蛋白质带电荷数的因素目前认为有两个,一方面大多数PEG修饰的位点是蛋白质表面的游离氨基,由于氨基在酸性和中性环境下结合氢质子而带正电荷,PEG修饰蛋白质后这些氨基失去与氢质子结合能力,蛋白质的正电荷数会减少,等电点偏酸。另一方面PEG自身不带电荷,当PEG覆盖于蛋白质表面时可能会阻碍蛋白质与离子交换树脂侧链的结合,从而导致修饰蛋白质的洗脱盐浓度比天然蛋白质低。采用离子交换层析分离PEG修饰蛋白质的最大优势在于PEG不带电荷保证了它不会吸附于柱上,因而可以很方便的将PEG与蛋白质分开。刘丽军等用CM Sepharose FF分离PEG修饰的rhIFNa-2b,洗脱峰依次为未结合的PEG、多点修饰产物、单点修饰产物和未修饰的rhIFNa-2b。根据结果分析PEG修饰蛋白质在离子交换层析中主要受PEG屏蔽作用影响,无论是用阴离子还是阳离子交换层析,蛋白上偶联PEG个数越多,结合力越弱,出峰越早;其次受氨基修饰的影响,由于阴离子交换树脂结合的主要是蛋白质的羧基,受氨基修饰影响较小,因而分离效果不如阳离子交换树脂。离子交换层析时缓冲液pH值至少应与蛋白质等电点相差一个单位,修饰样品应用缓冲液或水稀释以降低样品的离子强度。

疏水层析和反相色谱法

疏水层析和反相层析的原理是分离介质带有疏水侧链,蛋白质在高盐浓度溶液或有机溶剂中变性,暴露出疏水部位,与分离介质结合,降低盐浓度或有机溶剂浓度可将其洗脱下来。PEG具有两亲性,但与蛋白质相比疏水性更强,因此PEG修饰蛋白质的疏水性强于天然蛋白,与分离介质的结合力更强,较天然蛋白晚出峰。Katre等采用疏水层析的梯度洗脱法成功将rIL-2与PEG-rIL-2分开。反相层析由于使用有机溶剂作为流动相,导致蛋白质失活,一般用来分析而不是分离活性蛋白。


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